北京中科白癜风医院公益抗白 http://news.360xh.com/202004/16/56770.html
非创伤性股骨头坏死的发病机制有多种学说，目前尚未有一种能满意解释。激素、酒精、创伤、镰状红细胞病、代谢性疾病、肿瘤均与股骨头坏死发生有关，但为什么相同的继发因素作用于患者，有些发生了骨坏死，有些又可幸免。此可能与基因多态性有关。目前研究集中对与高凝和低纤溶相关的基因位点，影响血管内皮细胞功能的相关基因位点，脂代谢相关的基因位点以及与药物代谢相关基因位点等探索。随着人类基因组研究进展，新一代高通量的基因检测手段应用，不久的将来，股骨头坏死的基因组变异、致病/耐受相关的单核苷酸多态性（SNP）、致病基因和易感基因会逐渐明了。人类终会找到骨坏死生物标记及药物干预靶点，从而为骨坏死的早期诊断及有效干预找到新方法，并为开发筛选各种非创伤性骨坏死易感基因芯片奠定基础。
RT-PCR对相关基因的检测
一、现状
（一）凝血相关因子的基因多态性与股骨头坏死
1.凝血因子与非创伤性股骨头坏死大量的研究表明股骨头坏死与某些凝血因子相关。凝血因子Vleiden变异是常见的具有高凝倾向的变异，其突变发生在基因位点上，由G替代A，CGA替代了CAA，导致Ⅴ因子肽链点精氨酸替代谷氨酰氨。尽管基因突变并未改变Ⅴ因子的活性，但发生突变点恰好位于蛋白C作用点，该点基因突变导致蛋白C对Ⅴ因子的灭活作用消失，Ⅴ因子不能失活，持续发挥凝血功能，最终使机体处于高凝状态。正常人群ⅤLeiden因子出现率为3%~5%，而深静脉血栓形成患者中出现率为20%，家族性凝血倾向患者中出现率高达50%。股骨头坏死患者也明显升高。
我们对汉族骨坏死人群凝血基因的检测
有学者认为儿童缺血性股骨头坏死（LCPD）与高凝低纤溶有关。到目前已有三项研究发现在LCPD患者中凝血因子V变异与骨坏死发生有关，但也有报道未得出相同结果。Szepesi等认为凝血因子Vleiden变异纯合子与骨坏死的严重程度相关。大多数研究证明该变异与股骨头坏死相关。Poort等对位于凝血酶原基因3′末端未翻译区进行检测，发现GA的多态性与凝血危险性增加有关，但关于此多态是否与股骨头坏死有关尚无一致的报道。与血栓形成相关的基因是凝血酶原GA突变，在白种人正常人群中，仅有1-3%，而易栓症患者中可达5-10%。
2.组织纤型溶酶原活化剂抑制因子1（PAI-1）组织型纤溶酶原活化剂（tPA）是一种丝氨酸蛋白酶，切割纤溶酶原，从而激活纤溶酶防止DIC的发生。PAI-1可以抑制其活性，已有多项研究证明PAI-1启动子区4G/5G多态性与血栓性疾病明显相关，其中4G/4G型可增加血浆中PAI-1水平，导致血液凝固性增加。Glueck等发现在股骨头坏死患者中4G/4G型明显高于正常人群。Ferrari研究肾移植术后骨坏死的患者发现，PAI4G/4G与骨坏死之间有肯定关系，但其他相同课题报道均未得出肯定关系。French等对急性淋巴母细胞白血病患者进行检测，发现PAI-1（rs）与骨坏死相关，G/A与AA基因型骨坏死易感性明显增加。
3.血管内皮生长因子（VEGF）Kim等对位骨坏死患者和位正常人检测了VEGF三个位点的多态性（-C/A，-G/Cand+C/T），发现-G/C增加了骨坏死的发病率。
4.GPIIb/IIIa（血小板膜表面糖蛋白）GPIIb/IIIa是在血小板粘附聚集过程中起重要作用的粘附分子受体，能结合纤维蛋白原、VWF等多种粘附蛋白，它和vW因子及胶原在血小板粘附和聚集方面扮演重要角色，已有研究表明GPIIIaP1A1/A2基因多态中P1A2等位基因是动脉系统疾病的一个危险因素，但尚未发现与股骨头坏死有关。
5.一氧化氮合成酶（eNOS）NO有血管舒张作用，并抑制血小板的聚集，调节平滑肌的增殖，eNOS控制NO的生成，有人发现，eNOS基因多态与股骨头坏死有关，认为等位基因4a在eNOS基因4号内含子的VNTR多态作为特发性股骨头坏死的一个危险因素。Glueck等发现eNOS基因在-位点的C被T代替，导致血管收缩，血小板聚集，血管生成减少，骨形成减少，且与骨坏死有关。他们对95位患者（36位特发性骨坏死，59位继发性骨坏死）检测时发现，特发性骨坏死中8例（22%）为TT型，匹配的对照组TT型为1位(3%)；19位(53%)特发性骨坏死为TC(杂合)型，匹配的对照组TC型为10位(28%)；9位(25%)患者为CC（野生）型，对照组为29位(69%)。Logistic回归分析表明eNOS的-T/C变异与骨坏死相关。59名继发性骨坏死患者，与相匹配的对照组比较，未发现统计学意义。特发性与继发性骨坏死患者相比较，eNOS基因变异可能性更高，其中T等位基因出现率更高(49%vs30%)。
6.5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）MTHFR基因的位核甘酸编码区处于MTHFR与叶酸的结合区，叶酸与之结合可增加酶的稳定性和活性，进而降低血浆中的同型半胱氨酸水平。如MTHFRC/T基因发生突变，则可导致酶的不耐热性，使该酶活性大大降低，从而使血浆同型半胱氨酸水平升高。已有大量研究表明血液中同型半胱氨酸浓度与血栓性疾病相关。Zalavras等对骨坏死患者检测了C/T和A/C两个位点，发现MTHFRC/T变异在一些股骨头坏死患者中明显增多，但也有一些研究未得出此结果。Chang对71位（51位酒精性，18位特发性，1位激素型，1位气压病）朝鲜族骨坏死患者进行检测时，发现MTHFR(C/T)与骨坏死有关，CT型与TT型易感性增加，MTHFR(A/C)则无统计学意义。
我中心对MTHFR基因的检测
(二)代谢相关基因
1.脂代谢相关基因Hirata等对例应用激素作免疫排斥的肾移植术患者筛选，34例诊断为骨坏死，例无骨坏死。检测4个SNP位点，包括ApoB的C/T和G/A，ApoA1的75G/A和83C/T；检测发现骨坏死组ApoB位点TT和CT出现率明显高于用激素而未发生骨坏死组，其他位点多态未见统计学意义，他们同时检测了血浆中的LDL，HDL，ApoB，ApoA水平，发现骨坏死组的ApoB/ApoA1明显高于无坏死组(P=0.)，他在另一研究中对位肾移植术后患者进行检测，包括apo(a)异构体（根据其分子量分为低分子量apo(a)组，和高分子量apo（a）组），血浆Lp(a)水平，同时检测了-G/A，+93C/T，和+G/A三个位点的多态性，结果发现，apo(a)分子量与骨坏死发生有密切关系，低分子量apo(a)患者中骨坏死发生率明显高于高分子量组，三个位点的SNP与血浆apo(a)水平均未发现与骨坏死发生率有关。
2.药物代谢相关基因Asano等研究了多药物抵抗基因MDRI（ABCB1），此基因编码药物转导蛋白（P-gp），上调P-gp可导致机体对多种药物产生耐药，包括激素类药物，他们评估了两个位置的多态性，26号外显子上的C/T和21号外显子上的2T/A，发现TT和2T/A基因型均对股骨头坏死有保护性作用，而且发现这两种多态连锁不平衡。此研究还发现，基因型为TT者增加了P-gp泵的活性，就此推断蛋白泵活性增加后阻止了激素在细胞内的积聚，从而减少激素对细胞的毒性作用。Yang等对位使用激素40mg/d冲击治疗的红斑狼疮患者进行跟踪检测，激素应用3个月后用MRI检测双侧股骨头，发现21例出现股骨头坏死，冲击疗法的患者骨坏死率更高，并对MDR1的2G/T和C/T进行检测，发现在出现骨坏死的患者中MDR1TT基因型明显少，骨坏死组中MDR12TT型出现率也少于未发生骨坏死的病人组，推测MDR1(ABCB1)基因此两位点的多态可能与骨坏死易感有关。最近的mete分析结果显示TT基因型明显降低股骨头坏死发生率。而对于皮质激素受体基因的研究表明绝大多数位点的变异与股骨头坏死无相关性，但是在bcll的等位基因G明显增加股骨头坏死的概率。
细胞色素P参与脂溶性药物的代谢，包括激素类药物。Asano等检测了细胞色素P，尤其是CYP3A4，CYP2D6，CYP2C19亚型和CYP3A4启动子区域，但未发现与骨坏死相关的多态性。在最近的急性淋巴细胞白血病（ALL）合并骨坏死研究中，发现TYMS2/2和维生素受体CC基因型与骨坏死相关，该作者认为此类基因型可能使细胞对甲氨喋呤和激素更敏感。
Tamura等对肾移植术后患者分析了GR，CBP，CYP3A4，NCoA2的基因单核苷酸多态性，发现在发生骨坏死的患者中CBP基因A/G等位基因出现率为32.4%，而未发生骨坏死的患者仅为14.6%，有明显统计学相关性，其他三个基因的多态均未发现与对照组不同，因此推测CBP基因的SNP可能与骨坏死发生易感性相关。Fujioka等发现ABCB1C/T，CBP(rs)多态性与激素性骨坏死患者有关。
PON1是杀虫剂代谢酶，有关研究显示有机磷的毒性作用影响骨的形成及构建，PON1QR基因多态与活性相关，PON1R等位基因携带者显示对氧磷酶活性较低，Hadjigeorgiou等研究发现对氧磷酶的PON1QR基因多态与骨坏死相关，他们检测了PON1的两个多态性(M55LandRQ)，研究显示与其他基因型相比PON1QQ基因增加了股骨头坏死的发生率，这种表现在股骨头坏死伴有脑白质损伤患者中尤为明显，该作者推测，PON1Q等位基因携带者在解毒方面有一定的缺陷，这可能与股骨头坏死和脑白质损伤的发病机制有关。
3.酒精代谢相关基因Chao等认为酒精代谢速度的不同可能归因于酒精代谢酶的功能多态性。试图发现该基因多态的分布是否与股骨头坏死和其他对酒精敏感的疾病（肝硬化，急性胰腺炎和食管癌）有关，并对ADH1，ADH2，ALDH2和P2E1(RsaI和PstI)基因进行了检测，发现基因型为ADH22/2者酒精代谢更快，尽管发现ADH2*1等位基因在骨坏死组比肝硬化组出现率更低，但并未发现某一基因型骨坏死发生率更高。ALDH22/2基因型在骨坏死组比正常对照组出现率低；在P2E1基因型与骨坏死发生率之间未发现相关性。也有研究表明MMP-3rs和MMP-8rs和MMP-8rs25394对d酒精性股骨头坏死有影响，前两者可以降低骨坏死发生率，二后者却增加坏死发生率.
4.SOX9与股骨头坏死的关系SOX9在出生前的软骨形成和出生后的软骨修复中均扮演重要的角色，在一致个股骨头坏死病人和个健康人的对照研究中发现rs的单体型A-A，GG和AA基因型均明显增加股骨头坏死的风险，同时更容易发生双侧坏死，另外A-A单体型与股骨头坏死后进展速度相关。血清内SOX9含量检测也发现SOX9蛋白在健康人群组含量明显低于病人组。在这组病人的研究中还发现血清中IGFBP3蛋白和胰岛素样生长因子1(IGF1)浓度在骨坏死组患者中要高于对照组，rs[C/T]和rs[A/G]与骨坏死相关，而且前者与骨坏死的分期也相关。
我中心对骨坏死与对照人群的代谢相关基因检测
（三）其他基因的检测
低氧耐受因子α(HIF1α)Hong发现HIF1α基因多态性与骨坏死相关。他们对位（特发性例，激素性59例，酒精性例）骨坏死患者进行检测，发现HIF1α有4个基因多态位点(-C/A，+T/C，+45C/T，+C/T)，其中-C/A，+T/C和+C/T与特发性骨坏死明显相关，P值分别为0.，0.，0.，另外发现HIF1α单倍体(CT，CC)也与骨坏死发生明显相关，这显示HIF1α在股骨头坏死发生过程中也扮演一定角色。膜联蛋白基因的rsSNP(A/G,G/G)在镰状红细胞病伴有股骨头坏死的病人中要明显高于对照组，其具体原因尚未分析明确。OPG基因中rs和rs与酒精性股骨头坏死明显相关，其中后者的OR值能够达到3.32；在同一个研究中还发现RANKL基因中（rs）的变异明显增加股骨头坏死的概率。
台湾Liu等检测三个股骨头坏死的家族中所有患者时，发现COL2A1基因在33外显子及50外显子各有一个位点的突变，而家族中未患骨坏死的人没有突变，可见基因变异可能也是股骨头坏死的一个原因。MiyamotoY等也发现几个家族的多名成员患有股骨头骨骺坏死（LCPD），检测发现所有这些患者均有COL2A1基因50外显子位置有错义突变(G/A)，而其他健康成员均正常，由此并推断该基因突变与LCPD有关，而且推测该突变可能在散发的LCPD上也存在。
台湾学者对COL2A1基因的检测（fromNEMJ）
二、医院骨坏死中心的工作
中心对假定为骨坏死的一些致病候选基因进行了深入研究，包括筛选凝血和纤溶的项目及相关基因、多药基因-1（ABCB1）编码的P-多糖蛋白单核苷酸多态性（SNP）外显子26、肝脂肪酶基因启动子G/A（SNP）、肝脂肪酶基因C/T、肝脂肪酶基因NlaⅢ酶切位点-限制性片段长度多态性ALDH2基因第12外显子内第密码子、载脂蛋白APO-E基因进行限制性片段长度多态性(RFLP)基因分型（位点和位点上半胱氨酸和精氨酸的互换是形成这种多态性的分子基础）、脂联素基因+45位核苷酸T/G、脂联素基因T/G位核苷酸、凝血因子XIIIVal34Leu基因多态性、血管内盘生长因子受体（VEGFR）-2基因启动子多态-T/C的频率分布、eNOSGlu/Asp多态性、eNOS基因4号内含子重复序列多态性、eNOS基因TC重复序列多态性、eNOS基因GT重复序列多态性等进行了研究，得到部分预期结果。
通过对SARS后骨坏死血液样本的检测，发现非创伤性骨坏死患者的凝血指标异常，对黄种国人骨坏死易感人群可用高凝和低纤溶特殊检查做筛选，PC、APC-R、AT-III、PAI、PLG、ACL可作为骨坏死易感因素的筛选指标。国人骨坏死与因子VLeiden和凝血酶原GA突变无关，有种族特异性。PAI-1基因4G/4G和ApoBCT以及药物代谢酶CYP和多耐药基因ABCB1可能是黄种国人骨坏死的遗传标记。
SARS后骨坏死的基因检测
在酒精性骨坏死的基因多态性研究中，我们使用DNA测序方法，根据所测DNA序列检测MTHFR位点多态性，并对该位点C/T多态性进行统计学分析发现了亚甲基四氢叶酸还原酶C/T单核苷酸多态性有相关性。同时进行肝脂肪酶启动子区域的DNA测序，找出出现SNP的位点，统计其基因型及等位基因频率，并进行病例-对照关联分析（图3-4-3）。结果所测区域发现rs、rsSNP位点，该位点在对照组及病例组均符合Hardy-Weinberg遗传平衡，分析提示两个位点存在完全连锁不平衡。各位点SNP杂合度不一致，且杂合度可能与人种有关，证实骨坏死与rs、rs两个SNP位点无相关性。
我们对酒精性骨坏死DNA测序检测
三、展望：
（一）外显子组检测在股骨头坏死基因检测中的应用
从目前的研究来看，骨坏死为多因素致病疾病，而非单一基因疾病，由此可见，在浩瀚的基因海洋中去选取假定可能有问题基因的传统检测方法，有较大的偶然性和盲目性。那种以假说为导向的传统疾病研究模式，即首先假设某基因为致病候选基因，再对其进行深入研究，一次只能研究单个或几个基因，如同大海捞针，瞎子摸象，而现代的、工业化的重大疾病研究模式，是以数据为导向，对物种或个体进行基因组水平的大规模研究，即在掌握基因组全局的情况下，发现影响疾病的基因位点。能够检测全部基因的全基因组扫描被认为是发现致病基因的希望，因此通过基因测序，检测出基因不同表达将会探索出高危人群的易感因子，但是大样本量、高昂的费用以及对所发现异常基因性质与功能进行后续确认的困难性，大大限制了它的实际应用。美国国家心肺血液研究所与其他研究机构合作，通过对12名研究对象的基因外显子进行测序，证实了使用外显子测序方法筛选罕见致病变异基因的可行性和应用价值。他们的研究表明，对于单个基因变异引起的疾病，外显子测序同样可以准确找到致病基因，与全基因组测序无异。研究人员认为，外显子测序也可用于多重基因变异引起的常见疾病。
在染色体上组成基因的DNA片段分为编码顺序和非编码顺序两部分，编码顺序为外显子，是携带遗传信息的有效片段。外显子是人类基因的一部分，包含着合成蛋白质所需要的信息。全部外显子称为“外显子组”（exome），只占人类基因组的百分之一。测定外显子序列只需针对外显子区域的DNA即可，因此远比进行全基因组序列测序更简便、经济，已成为现阶段基因测序工作的重要手段。通过Nimblegen商业化2.1M外显子序列捕获芯片结合目前Solexa高通量测序技术能直接解读人类外显子信息。目前一张2.1M芯片能同时捕获约18万个外显子和约个miRNA，几乎覆盖了所有人类外显子区域，相对于传统的PCR方法，该方法极大地提高了对于人类基因组中外显子区域的研究效率，并显著降低了研究成本。与常用的人类基因组测序相比，外显子测序在检测基因变异方面，无论是普通变异还是罕见变异，都表现出很高的灵敏度，有望识别一系列DNA错拼，如单核苷酸多态性变异（SNPs），以及基因序列的插入和删除。
我们前期对骨坏死外显子组检测
（二）数字化基因表达谱在股骨头坏死基因检测中的应用
基因转录表达水平的检测和分析是功能基因组学研究的一个主要内容和方法。一个细胞的基因转录表达水平能够精确而特异地反映其类型、发育阶段以及应激状态。检测基因转录表达水平是分子生物学的一个常用实验，与其它方法相比，基于新一代高通量测序技术的数字化基因表达谱（DigitalGeneExpressionProfile，DGEP）分析具有三个无与比拟的优势：（1）数字化信号：DGEP的定量敏感性水平达到1个拷贝，定性敏感性能够区分单碱基不同的序列，从而更加真实地评价细胞中全部基因的表达。（2）极强检测能力：DGEP一次实验可以检测五百万条mRNA分子的表达，可以涵盖细胞中几乎所有表达的基因，是已知技术中通量最高的。由于实验步骤简单，无背景噪音，可以最大可能地检测低丰度基因。（3）获取未知转录本：DGEP不需事先知道或获得目标基因序列，可以检测未知基因的表达，并且是发现新基因的一种方法。DGEP拥有极其广泛的应用领域，例如，全基因组表达图谱绘制；差异基因表达谱研究；基因功能研究；基因动态研究；疾病相关基因表达研究；药物作用机制或毒理学的研究等，通过大样本量的DGEP测序，从基因表达水平上进行进一步研究，将能够从基因水平上揭示皮质类固醇性骨坏死的发病原因，明确发现皮质类固醇性骨坏死高危人群易感基因，寻求诊断、预后和治疗靶点。
我们应用二代测序技术检测应用体外震波后BMECs转录组的表达差异
股骨头坏死的基因检测研究显示，基因变异通过影响到软骨构成，骨代谢，解毒，凝血系统及血管内皮功能参与骨坏死的发病过程，基因研究除了能够更清楚的观察骨坏死的发病机制以外，还能为骨坏死的干预和治疗提供帮助，它能够在患者应用激素前判断骨坏死发生的可能性，从而采取干预措施，从源头上减少或避免骨坏死的发生。
